hplc怎么时候用磷酸（磷酸在高效液相色谱的作用）

1. hplc纯化步骤
2. hplc纯化引物步骤

hplc纯化步骤

　　分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽在几分钟内高度被分析。

　　HPLC分两类：离子交换和反相。离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用，通过可变PH， 离子强度，或两者洗脱出多肽，通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽从柱中洗脱出。离子交换分离的一个则使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。

　　反相HPLC条件与正常层析相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱，如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的，高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而，总体实践中，这两类柱互变无多少显著差别。另一类载体由碳水化合物构成，比如苯基。

　　典型的操作常由两种缓冲剂组成，0.1％TFA-H2o和80％ acetonitrile 0.1％TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5％到1.0％改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)。

　　大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1％磷酸，稀He formic酸(5-6％, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成不同的缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高pH环境，甚至微碱pH，因为这样会破坏柱子

hplc纯化引物步骤

步骤如下：

1) 用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

2) 将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；

3) 由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；

4) 在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

到此，以上就是小编对于磷酸在高效液相色谱的作用的问题就介绍到这了，希望介绍的2点解答对大家有用，有任何问题和不懂的，欢迎各位老师在评论区讨论，给我留言。